Анотація до роботи:

Музичка О.В. Кінетичні закономірності інгібування лужної фосфатази з кишок теляти L-цистеїном, відновленим глутатіоном і фосфоновими кислотами. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2004.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню кінетичних закономірнос-тей інгібування лужної фосфатази з кишок теляти природними тіольними антиоксидантами – L-цистеїном, відновленим глутатіоном, дигідроліпоєвою кислотою, – а також пошуку і вивченню нових фосфорорганічних інгібіторів цього ферменту. Встановлено, що взаємодія відновленого глутатіону з лужною фосфатазою характеризується утворенням комплексів фермент-інгібітор і фермент-субстрат-інгібітор, при цьому останній здатний розкладатися до неорганічного фосфату (частково змішаний тип інгібування). Запропоновано двостадійний механізм зв’язування L-цистеїну лужною фосфатазою, який включає швидке утворення первинного комплексу інгібітора і його повільну фіксацію в активному центрі ферменту. Показано, що інгібування відновленим глутатіоном і L-цистеїном залежить від природи ізоформ лужної фосфатази. Обгрунтовано оригінальний напрям дизайну інгібіторів лужної фосфатази, що полягає у використанні макроциклічної платформи для одного або двох залишків фосфонової кислоти. Досліджено властивості калікс[4]аренметилен-бісфосфонових кислот – нових ефективних інгібіторів лужної фосфатази.

1. Вплив відновленого глутатіону на активність лужної фосфатази з кишок теляти описується закономірностями частково змішаного інгібування, що свідчить про утворення комплексів фермент-інгібітор та фермент-субстрат-інгібітор, а також здатність останнього розкладатися до продукту реакції. Проаналізовано залежність уявних кінетичних параметрів ферментативної реакції від концентрації інгібітора і розраховано константи інгібування. Результати дослідження обгрунтовують механізми можливого впливу відновленого глутатіону та інших природних тіольних антиоксидантів на функціонування цього ферменту in vivo.

2. На підставі аналізу кінетики інгібування лужної фосфатази L-цистеїном (за змішаним типом) взаємодію інгібітора з ферментом охарактеризовано як двостадійний процес, що включає утворення первинного комплексу і наступну повільну стадію його стабілізації в оточенні ферменту. Розраховано мікроскопічні константи швидкості повільної стадії фіксації L-цистеїну в активному центрі лужної фосфатази.

3. Встановлено особливості впливу L-цистеїну та відновленого глутатіону на активність гідрофільних і гідрофобних форм лужної фосфатази, одержаних після розділення ферменту на октилсефарозі. Гальмуючий ефект, що проявляється в зростанні значень уявних констант інгібування K_i і K_i, зменшується при переході від гідрофільних до гідрофобних фракцій ферменту.

4. Представлено нову модель функціонування лужної фосфатази в присутності амінофосфонових кислот, яка включає не тільки інгібування ферменту, але і його активацію (рН 10-10,5). Активуючий вплив залежить від природи амінофосфонової кислоти. Показано, що -амінофосфонові кислоти сприяють утворенню і наступному розкладу комплексу Міхаеліса, а -аміно-фосфонові кислоти промотують перетворення цього комплексу, активуючи або гальмуючи його утворення.

5. Продемонстровано перспективний підхід до дизайну інгібіторів лужної фосфатази, згідно з яким гідрофобний макроцикл – калікс[4]арен – використовується як платформа для діючого бісфосфонатного або амінофосфонатного фрагменту. Значне зростання ефективності інгібування спостерігається при введенні в структуру калікс[4]арену одного або двох фрагментів фосфонової кислоти. Встановлено, що калікс[4]аренбісметилен-бісфосфонова кислота є сильним інгібітором лужної фосфатази з кишок теляти з K_i 0,38 мкМ і K_i 2,8 мкМ.

Публікації автора:

1. Вовк А.И., Музычка О.В., Харченко О.В. Кинетика и механизм взаимодействия L-цистеина со щелочной фосфатазой из кишок теленка // Укр. біохім. журн. – 2003. - Т. 75, № 6. - С. 35-39.

2. Музычка О.В., Харченко О.В., Вовк А.И. Кинетические особенности влияния L-цистеина на активность гидрофильных и гидрофобных форм щелочной фосфатазы // Доповіді НАН України. – 2003, № 11. – С. 147-152.

3. Музычка О.В., Харченко О.В., Вовк А.И. Восстановленный глутатион как ингибитор щелочной фосфатазы // Доповіді НАН України. – 2004. – № 4. – С. 131-135.

4. Vovk A.I., Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Kukhar V.P., Muzychka O.V., Lozynsky M.O. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors // Org. Biomol. Chem. - 2004. - Vol. 2, № 21. - Р. 3162-3166.

5. Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Solovyov A., Muzychka O.V., Vovk A.I., Kukhar V.P. Bіо-relevant derivatives of calixarene phosphonic acids // 16th International conference on phosphorus chemistry. Abstracts. - Birmingham, UK, 2004. - P. 84.