Диссертации и авторефераты Украины
Перейти на каталог
Каталог авторефератов

Я ищу:
Диссертация / Автореферат

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua
Тема автореферата диссертации: Антигенна структура білків оболонки двох українських штамів М-вірусу картоплі 2003 года.
Источник: Автореф. дис... канд. біол. наук: 02.00.10 / Т.Ю. Ткаченко; НАН України. Ін-т біоорган. хімії та нафтохімії. — К., 2003. — 20 с.: рис. — укp.
Аннотация: Уперше проведено імунохімічний аналіз двох українських штамів PVM U1 і PVM U7 за допомогою моноклональних антитіл. Локалізовано антигенні детермінанти, які специфічно розпізнаються MKA M6D5 і M9G1 на поліпептидних ланцюгах білків оболонки PVM U1 І PVM U7, та установлено розташування антигенних детермінант, що взаємодіть з MKA M4C1, M6D5 і M9G1, відносно одна одної. Показано, що N-кінцева ділянка білків оболонки (БО) PVM експонована на поверхню білкової субодиниці та вірусної частки. Шляхом модифікації пептидів цитраконовим ангідридом визначено внесок бокової групи лізину у взаємодію антигенних детермінант з відповідними антитілами. Здійснено аналіз синтетичних аналогів пептидів, що розпізнаються MKA M6D5 і M9G1, та установлено внесок негативно заряджених залишків амінокислот у формування комплексу антиген-антитіло. На підстві результатів аналізу та порівняння первинних і вторинних структур БО карлавірусів виявлено особливості, властиві лише їм, а також ряд спільних ознак в організації капсидних білків вірусів зі спиральним типом капсиду. Уперше запропоновано загальну схему вторинної структури БО карлавірусів.

Текст работы:

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ





ТКАЧЕНКО Тетяна Юріївна


      УДК 577.112.5:57.083.3



АНТИГЕННА СТРУКТУРА БІЛКІВ ОБОЛОНКИ ДВОХ УКРАЇНСЬКИХ ШТАМІВ М-ВІРУСУ КАРТОПЛІ



02.00.10 біоорганічна хімія





АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук





Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі структури і функції білків та пептидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.




Науковий керівник:                кандидат біологічних наук

Вітер Сергій Сильвестрович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН

України, старший науковий співробітник відділу

структури і функції білків та пептидів



Офіційні опоненти:                доктор біологічних наук, професор

                                       Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН

України, завідувач відділу хімії білка


доктор біологічних наук

Щербатенко Іван Степанович,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач

відділу фітопатогенних вірусів


Провідна установа:        Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ молекулярної імунології


Захист відбудеться  13 червня 2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 12 травня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                        Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ


Актуальність теми. Вірусні хвороби рослин спричиняють значні втрати врожаю та зниження якості сільськогосподарської продукції. Необхідність вивчення фітовірусів на Україні визначається, в першу чергу, тим, що більша частина території України це райони інтенсивного землеробства. Розробка високочутливих та специфічних методів діагностики фітовірусів і ефективних заходів боротьби з ними потребує детального вивчення їх біологічних та структурно-функціональних характеристик. Цінну інформацію щодо структури вірусних білків, організації вірусної частки, деяких функціональних характеристик вірусів рослин можна одержати шляхом вивчення їх антигенної структури. Одним з критеріїв оцінки ступеню спорідненості вірусів рослин є їх антигенні властивості. Вивчення антигенної структури фітовірусів та їх білків є підґрунтям для створення чутливих імунохімічних тест-систем для виявлення та ідентифікації вірусів в рослинному матеріалі, а також становить суто теоретичний інтерес, оскільки фітовіруси є безпечними та зручними моделями для дослідження таких фундаментальних проблем біоорганічної хімії як механізми білок-білкової та білок-нуклеїнової взаємодії, самоорганізація макромолекулярних комплексів.

Антигенні властивості карлавірусів, незважаючи на широку розповсюдженість представників цієї групи та високу враженість ними виробничих посівів в світі та в Україні, на сьогодні залишаються маловивченими. Зручних методів швидкої та точної діагностики  карлавірусів в Україні не розроблено. Аналіз антигенної структури окремих вірусів карлагрупи за допомогою моноклональних антитіл є необхідним кроком на шляху створення імунохімічних тест-систем для виявлення та ідентифікації карлавірусів, зокрема М-вірусу картоплі (Potato virus M PVM), а також може надати інформацію щодо особливостей просторової організації субодиниць структурного білка та вірусної частки в цілому.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах тематичних планів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема № 2.1.10.14) “Дослідження фізико-хімічної та антигенної будови білка Р69 кашлючного мікроба, дифтерійного токсину та капсидних білків деяких штамів М-вірусу картоплі” (номер держреєстрації 0197U009977).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в локалізації та характеристиці антигенних детермінант білків оболонки (БО) двох українських штамів М-вірус картоплі (PVM U1 та PVM U7) за допомогою трьох моноклональних антитіл (МКА), а також у виявленні особливостей первинної та вторинної структури БО ряду карлавірусів.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

  1. Проаналізувати за допомогою МКА фрагменти, одержані в результаті ферментативного протеолізу білків оболонки PVM U1 і PVM U7, та встановити амінокислотну послідовність пептидів, що розпізнаються МКА.
  2. Визначити розташування антигенних детермінант на поліпептидному ланцюзі білка оболонки відносно одна одної.
  3. Охарактеризувати визначені антигенні детермінанти шляхом аналізу синтетичних аналогів та модифікованих похідних відповідних фрагментів.
  4. Провести множинне вирівнювання первинних структур білків оболонки карлавірусів та виділити консервативні мотиви, специфічні для білків оболонки карлавірусів.
  5. Провести передбачення та множинне порівняння вторинних структур білків оболонки карлавірусів і вивести загальну схему організації вторинної структури, характерної для білків оболонки карлавірусів, зокрема для PVM.

Обєкт дослідження білки оболонки двох штамів PVM U1 та PVM U7, виділених в Україні в зоні Полісся.

Предмет дослідження антигенні властивості та структурні характерис-тики субодиниць білка оболонки та вірусних часток PVM U1 та PVM U7.

Методи дослідження. При аналізі антигенної структури білків оболонки PVM U1 та PVM U7 використані такі методи біоорганічної хімії та біохімії, як ферментативний гідроліз білка, фракціонування пептидів методом ВЕРХ, гель-електрофорез, хімічна модифікація пептидів, дот імуноблотинг, імуноферментний аналіз (ІФА) та інгібування ІФА; при аналізі первинної та вторинної структури БО карлавірусів методи множинного вирівнювання послідовностей, пошуку мотивів в білкових базах даних та передбачення вторинної структури.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено імунохімічний аналіз двох українських штамів PVM U1 та PVM U7 за допомогою моноклональних антитіл. Вперше локалізовано антигенні детермінанти, які специфічно розпізнаються МКА M6D5 та M9G1 на поліпептидних ланцюгах білків оболонки PVM U1 та PVM U7, та встановлено розташування антигенних детермінант, що взаємодіють з МКА М4С1, M6D5 та M9G1, відносно одна одної. Показано, що N-кінцева ділянка БО PVM експонована на поверхню білкової субодиниці та вірусної частки. Шляхом модифікації пептидів цитраконовим ангідридом встановлено внесок бокової групи лізину у взаємодію антигенних детермінант з відповідними антитілами.

Проведено аналіз синтетичних аналогів пептидів, що розпізнаються МКА M6D5 та M9G1, та визначено внесок негативно заряджених залишків амінокислот у формування комплексу антиген-антитіло.

Аналіз та порівняння первинних та вторинних структур БО карлавірусів дозволили виявити особливості, властиві лише карлавірусам, а також ряд спільних ознак в організації капсидних білків вірусів зі спіральним типом капсиду. Вперше запропоновано загальну схему вторинної структури БО карлавірусів.

Практичне значення отриманих результатів. Локалізація та характеристика антигенних детермінант, що знаходяться на поверхні вірусної частки та розпізнаються PVM-специфічними МКА, дозволяють створити зручні та чутливі тест-системи для експрес-діагностики PVM.

За результатами множинного вирівнювання амінокислотних послідовностей БО карлавірусів були виділені специфічні для білків оболонки карлавірусів мотиви, які можуть бути застосовані як один з критеріїв встановлення приналежності вірусних білків оболонки до групи карлавірусів.

Особистий внесок здобувача. Виділення БО PVM U1 та PVM U7, гель-електрофорез, розщеплення БО PVM U1 та PVM U7 трипсином та термолізином, модифікація пептидів цитраконовим ангідридом, імунохімічний аналіз БО, його фрагментів та їх синтетичних аналогів, а також аналіз первинної та вторинної структури БО двадцяти трьох карлавірусів здійснені особисто здобувачем. Результати дослідів, що опубліковані в статтях зі співавторами, і що увійшли до дисертації, одержані особисто дисертантом. Віруси штамів PVM U1, PVM U7 та PVM U2 були ізольовані в Інституті сільськогосподарської мікробіології НААН України (м. Чернігів) та накопичені разом зі співробітником цього інституту к.б.н. Л.П. Коломієць. Моноклональні антитіла M6D5, M9G1 та M4C1 були отримані в Інституті хімічної та біологічної фізики АН Естонії (м. Таллінн) та любязно надані професором М.Ю. Саарма. Автор щиро вдячний співробітникам вищеназваних організацій.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на V Міжнародному симпозіумі з плюс-ланцюгових РНК-вірусів, “Fifth International Symposium on Positive Strand RNA Viruses” (Ст.-Петербург, Флоріда, США, 1998); II Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998); XV та XVIII Наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ 2000, 2003).

Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях Вченої ради та наукових семінарах в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Публікації. За результатами роботи опубліковано 3 статті в наукових фахових журналах та 2 тези у збірках міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (3 розділи, 11 підрозділів), висновків, списку літературних джерел (247 найменувань). Робота викладена на 128 сторінках машинописного тексту. Дисертація містить 19 ілюстрацій, таблицю та додаток.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


Огляд літератури. В огляді літератури представлені сучасні дані про організацію вірусної частки, структуру геному та білка оболонки представників роду карлавірусів, зокрема PVM, а також висвітлено стан та перспективи досліджень антигенної структури деяких фітопатогенних вірусів зі спіральним капсидом.

Матеріали та методи досліджень. Віруси штамів PVM U1 та PVM U7 накопичували на рослинах томатів та виділяли зі свіжого листя рослин через 30-40 діб після зараження (Николаева О.В. и др., 1985). БО PVM виділяли шляхом виморожування суспензії вірусів в присутності солянокислого гуанідину та хлориду літію (Wu G. J. and Bruening G., 1971). Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951). Чистоту та гомогенність препаратів вірусів та білків оболонки контролювали спектрофотометрично на приладах “SPECORD” (Німеччина) і СФ-16 (“ЛОМО”, Росія). Молекулярну масу білків оболонки PVM визначали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (ДСН) (Laemmli U.K., 1970) з використанням набору маркерних білків LMW Sigma Markers (“Sigma”, США).

Для аналізу антигенної структури БО PVM U1 (БО U1) та БО PVM U7 (БО U7) використовували МКА M6D5, M9G1 та M4C1, які були отримані до вірусних часток PVM (Російський штам PVM Ru) (Järvekьlg L. et al., 1989).

БО U1 та БО U7 розщеплювали трипсином та термолізином. Одержані суміші пептидів фракціонували методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в оберненій фазі на хроматографічній системі “LKB-PHARMACIA” (Швеція), на колонці “LiChrosorb RP-18”, 5 мкм, 250 х 4,6 мм; елюцію проводили в лінійному градієнті ацетонітрилу. Пептидні фракції аналізували методом непрямого ІФА (Clark M.F. and Adams A.N., 1977) на планшетах для мікротитру