Диссертации и авторефераты Украины
Перейти на каталог
Каталог авторефератов

Я ищу:
Диссертация / Автореферат

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua
Тема автореферата диссертации: Розробка трансгенних ліній Arabidopsis thaliana чутливих до хімічних мутагенів 2003 года.
Источник: Автореф. дис... канд. біол. наук: 03.00.15 / Надія Олександрівна Орел; Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва АМН України. — К., 2003.
Аннотация:

Текст работы:

ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ

АМН УКРАЇНИ ім. О.М. МАРЗЕЄВА



Орел Надія Олександрівна



УДК: 575.224.4+277.21+577.216


РОЗРОБКА ТРАНСГЕННИХ ЛІНІЙ

ARABIDOPSIS THALIANA ЧУТЛИВИХ

ДО ХІМІЧНИХ МУТАГЕНІВ



03.00.15-генетика




Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук





Київ - 2003

Дисертацією є рукопис


Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії МОЗ України та Інституті рослинної генетики (Гатерслебен, Німеччина)


Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор КОВАЛЬЧУК Лариса Євгенівна,Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України, кафедра медичної біології з курсом медичної генетики, завідувач кафедри


Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор ГОРОВА Алла Іванівна, Національний гірничий університет МОН України, завідувач кафедри екології

доктор біологічних наук МІШУНІНА Тамара Мар'янівна, Інститут ендокринології та обміну речовин АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії нейрохімії


Провідна установа:

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, м. Київ, відділ біофізики і радіобіології


Захист відбудеться "26".12.2003 p. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.604.02 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ, вул. Попудренка, 50.


З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ, вул. Попудренка, 50.


Автореферат розісланий "25".11.2003 р.



Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук                                                Омельченко Е.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ


Актуальність теми. Зростання забруднення навколишнього середовища в Україні набуває нині катастрофічного характеру (Сердюк А.М.,Тимченко О.І., 1997; Тимченко О.І., Сердюк A.M., Турос 0.І., 2000;). Першою чергою воно небезпечне тим, що спричинює негативні генетичні наслідки для наступних поколінь (Гойда Н.Г., 1997). Відомо, що синергетична дія екологічних факторів на спадковий апарат зумовлює близько 60% обсягу його пошкоджень, впливає на стан популяції та здоров'я людей, сприяє росту загальної захворюваності і особливо спадково зумовленої патології (Бариляк І.Р., Ду-ган О.М., 2002; Пілінська М.А. та ін., 2002). Надзвичайну небезпеку для людини і її нащадків становлять малотоксичні, але пошкоджуючі геном мутагени і канцерогени, більшість з яких виявляє генотокстичну дію і зумовлює патологічні зрушення в організмі (Ковальчук Л.Є, Нейко Є.М., 1996). Тому контроль над процесами забруднення, оцінка впливу мутагенних факторів на живі організми є актуальною проблемою (Горова A.І, 2002; Дуган О.М., Бариляк І.Р. 1995).

Описано понад 100 тест-методів для дослідження генотоксичності, які охоплюють різні рівні організації живого від бактеріофагів до ссавців. Регулярно застосовуються менше 20 з них, а деякі методи доступні лише спеціальним лабораторіям (Ковальчук О.В., 2000). Однак, універсального способу виявлення мутагенності хімічних сполук, радіонуклідів не існує; Тим більше, що для визначення внеску радіаційного або хімічного компоненту в пошкодження генетичного апарату необхідно проводити динамічне спостереження за станом довкілля забруднених регіонів, враховувати всі рівні організації спадкового апарату, а також різні види мутацій (Пілінська М.А., Дибський С.С., 2000).

Найдоцільнішими для розробки нових методів біоіндикації генотоксичності Є рослинні тест-системи, які доступні й відповідають описаним вимогам (Ковальчук Л.Є. та ін., 2002-2003; Ковальчук О.В., 1999-2000). Для виявлення інтенсивності мутагенного фону довкілля, спричиненого радіаційним забрудненням, використовується рослинна тест-система, запропонована вченими Івано-Франківської медичної академії та Інституту Ф. Мішера (Швейцарія), на основі трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana і Nicotiana tabacum. Однак при цьому передбачається застосування виключно двох ліній, які не дозволяють об'єктивно тестувати хімічні мутагени.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексних науково-дослідних робіт кафедри медичної біології з курсом медичної генетики та ЦНДЛ Івано-Франківської державної медичної академії "Механізми репарації точкових мутацій та виявлення нових генів, які беруть участь у цих механізмах. Вплив оксидантного стресу на рівень точкових мутацій у вищих еукаріот" (№ держреєстрації ВН № 03.23.067.99) - проект ЕМВО, фінансований Європейською молекулярно-біологічною Асоціацією (м. Хайдельберг, Німеччина) та "Впровадження та випробування нових тест-систем для біомоніторингу хімічного і радіонуклідного забруднення довкілля"
(№ держреєстрації 01024007289).

Мета роботи: підвищення ефективності тестування мутагенів за допомогою розробки і селекції нових ліній трансгенних рослин Arabidopsis thaliana, чутливих до хімічних чинників.

Задачі дослідження:

1. Встановити гени, які регулюють структуру хроматину ДНК та беруть участь у рекомбінаційних процесах у рослин, зробити конструкції знайдених генів у сенс- і антисенс орієнтаціях.

2. Створити лінії трансгенних рослин з досліджуваними генами методом агро-бактеріальної трансформації через вакуумну інфільтрацію.

3. Провести тестування отриманих ліній на чутливість до хімічних мутагенів.

4. Дослідити вплив трихостатину А на ефективність тимчасової та стабільної трансформації.

5. Провести апробацію отриманих трансгенних ліній рослин як тест-систем для індикації хімічного забруднення довкілля.

Об'єкт дослідження: трансгенні рослини, агробактерії, гени-регулятори хрома-тинової структури.

Предмет дослідження: фенотипові реакції і явища гомологічної рекомбінації, зумовлені хімічними мутагенами.

Методи дослідження: молекулярно-генетичний аналіз ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, агробактеріальна трансформація, створення конструкцій генів і векторів, біохімічні методи, статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше використано гени, що регулюють хроматинову структуру ДНК для отримання трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, визначено їхній вплив на частоту гомологічної рекомбінації.

Проведено дослідження впливу трихостатину А на ефективність трансформації у Arabidopsis thaliana. Здійснено комплексне дослідження трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana (Col-0 Bin AR/SiR-8; Col-0 BinAR/SiR-7; BAR BinAR/RPD3-1; BAR BinAR/RPD3-9; Col-0 pTA/SiR-2; Col-0 pTA/SiR-4; N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 і N1DC4 no.561 pMEX/SIR2№4) на чутливість їх до хімічних мутагенів в лабораторних і натурних умовах.

Доведено збільшення частоти явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації (ІГР) залежно від інтенсивності хімічного забруднення, візуальним маркером якого було відновлення перерваної версії GUS-гена (сині плями в різних органах рослин).

Практичне значення отриманих результатів. Одержані чутливі лінії трансгенних рослин (ТР) Arabidopsis thaliana до хімічного забруднення - Col-0 BinAR/SiR-8, Col-0 BinAR/SiR-7, Соl-0 pTA/SiR-2 та Col-0 pTA/SiR-4. При пророщуванні їхнього насіння у зразках грунтів із різних екологічних зон, спостерігалися найбільш виражені зміни фенотипу та відновлення GUS-гена. Встановлено доцільність використання даних ліній, як чутливих тест-систем, для оцінки рівня хімічного забруднення оточуючого середовища.

Водночас ідентифіковано дві лінії ТР Arabidopsis thaliana (N1DC4 no.561 pMEX/ SIR2 №2 і N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №4), стійкі до хімічних чинників в експериментальних умовах (при дослідженні генетичних ефектів сполук важких металів: кадмію, міді, свинцю, нікелю та хрому) та при висадженні у грунти різних регіонів Прикарпаття. Цей факт може бути використаний в подальших молекулярно-гене-тичних дослідженнях для отримання рослин, стійких до хімічних чинників.

Впроваджений результатів дослідження. Результати дослідження впроваджено в практику екологічного моніторування інтенсивності хімічного забруднення води та грунтів окремих міст Івано-Франківської області. Матеріали дисертації і методичні підходи використовуються при викладанні біології та біохімії на відповідних кафедрах Івано-Франківської державної медичної академії та Прикарпатського університету ім. В. Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною працею автора. Проаналізовано відповідну літературу, проведено підбір векторів, трансформацію і створення конструкцій генів, перенесення їх в Arabidopsis thaliana, здійснено натурний експеримент.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації апробовано на засіданнях наукового товариства в Інституті генетики рослин (Гатерслебен, 2001-2002), міжнародному конгресі молодих вчених з біотехнології (Київ, 2002), науково-практичній конференції "Актуальні питання гігієни та екологічної, безпеки України" (Київ, 2003), науково-практичній конференції "Імунотоксиканти, канцерогени, мутагени навколишнього середовища" (Київ, 2002), III з'їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003), конференції "Антропогенно змінене середовище України: Ризики для здоров'я та екологічних систем" (Київ, 2003).

Публікації. Відповідно до теми дисертації опубліковано 11 наукових праць, у тому числі - 3 статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 8-у збірниках, матеріалах, тезах конференцій і симпозіумів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 126 сторінках і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, двох розділів результатів досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, який включає 166 робіт (з них 37 кирилицею). Дисертація містить 17 таблиць та 27 рисунків.


ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


Матеріали та методи дослідження. Матеріалом дослідження слугували ТР родини гірчичних Arabidopsis thaliana, агробактерії Agrobacterium thumefaciens і Escherichia coli, гени - регулятори структури хроматину. Для трансформації використано два основні штами бактерій: 1) Escherichia coli - канаміцин-резистентний штам DH56 (фірма Gibco BRL, Eggenstein); 2) Agrobacterium thumefaciens - штам С58 Cl Rf, що містить ген резистентності до ріфампіцину. 55 трансформаційних експериментів проведено на рослинах Arabidopsis thaliana дикого типу екотипу Colambia (Col-0) та трансгенні рослини Arabidopsis thaliana екотипу С24: а) лінія N1DC1 no11, що містить З копії перерваного GUS гена в прямій орієнтації; б) лінія N1DC4 по.651, що містить 1 копію перерваного GUS гена в оберненій орієнтації. Лінії було надано професором X. Пухтою в Інституті генетики рослин (Гатерслебен, Німеччина).

Малекулярно-генеімчні методи. ДНК електрофорез проведено в 1% агарозному гелі з етидіем бромідом (кінцева концентрація 2,5 мг/мл) в ІХНАС буфері в горизонтальних пластинах.

Конструкції генів RPD3, SIR2 like і SU(VAR)3-7 отримано у відповідних векторах: pMEX, pTA7002, BinAR. Гени RPD3 і SIR2 були розташовані в антисенс - орієнтаціях, ген SU(VAR)3-7 - у сенс - орієнтації.

Трансформацію Е.соїі здійснено через тепловий шок.

ДНК з листків Arabidopsis thaliana виділено за методом Fulton (1995).

Саузерн-блот аналіз проведено через нерадіоактивну DIG систему, із застосуванням дигоксигенін - стероїдного гаптену. ДНК-проби було помічено DIG-dUTP через дві послідовні полімеразно-ланцюгові реакції (ПЛР).

Субстратом для ПЛР слугували плазмідна ДНК, ПЛР продукти та рослинна ДНК. Секвенування ДНК виконано за загальноприйнятими методами (Sanger T., 1977) у секвенаційній лабораторії Інституту генетики рослин під керівництвом професора X. Пухти (Гатерслебен, Німеччина).

Методи дослідження рослин. Стерилізацію насіння Arabidopsis thaliana проведено в Eppendo