Диссертации и авторефераты Украины
Перейти на каталог
Каталог авторефератов

Я ищу:
Диссертация / Автореферат

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua
Тема автореферата диссертации: Застосування реакції пірилоціанінів з амінами в синтезі кон'югатів піридоціанінів з біомолекулами 2003 года.
Источник: Автореф. дис... канд. хім. наук: 02.00.10 / О.М. Костенко; НАН України. Ін-т біоорган. хімії та нафтохімії. — К., 2003. — 19 с.: рис. — укp.
Аннотация: Вперше проведено реакцію пірилоціанінів з амінами за умов, що не спричиняють руйнування більшості біомолекул. Встановлено час перебігу даної реакції з різними амінокислотами, вивчено вплив природи амінокислоти, температури, pH середовища, природи буфера та розчинника на перебіг реакції. Показано, що у процесі реакції кон'югації пірилоціанінів з біомолекулами з використанням триетиламонійацетатного буферу не відбуваються побічні реакції з екзоциклічними аміногрупами нуклеотидних основ і бічними функціональними групами амінокислот. На підставі дослідження впливу будови пірилоціанінів на перебіг реакції з аміногрупою біомолекул і спектрально-люмінісцентних властивостей утворюваних піридоціанінів запропоновано низку пірилоціанінів для кон'югації з біомолекулами. Синтезовано модельні кон'югати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, досліджено спектрально-люмінісцентні властивості даних кон'югатів. Наведено для практичного використання зручний метод кон'югації пірилоціанінів з біомолекулами.

Текст работы:


НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООГРАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ




Костенко Олександр Миколайович



УДК 577.336+57.08.088.5+542.95




Застосування реакції пірилоціанінів з амінами в синтезі конюгатів піридоціанінів з біомолекулами



02.00.10 біоорганічна хімія





АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук







Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.


       Захист відбудеться 28 березня 2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.


       З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.


Автореферат розісланий   28 лютого 2003 р.


Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                               Д. М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Стрімкий розвиток молекулярної біології та біотехнології потребує швидких і зручних методів детекції нуклеїнових кислот (НК) та білків. На заміну радіоактивним міткам, що традиційно застосовуються з цією метою, приходять ефективніші, зручніші, дешевші та безпечніші спектрально-люмінесцентні методи детекції. Це вимагає пошуку як нових барвників, придатних для цієї мети, так і методів їх ковалентної конюгації з біомолекулами.

       Завдяки своїм унікальним спектрально-люмінесцентним властивостям ціанінові барвники є найчутливішими з нині існуючих флуоресцентних зондів для кількісного та якісного визначення НК. Молекулярні зонди, що містять ковалентно приєднану молекулу ціанінового барвника, успішно застосовуються для проведення полімеразної ланцюгової реакції, детекції НК в розчинах та гелях, для локалізації рецепторів у клітинах.

       Хоча реакція пірилоціанінів з амінами добре відома, систематичних досліджень взаємодії пірилоціанінів з біомолекулами не проводилось.

       Майже всі функціональні групи, які здатні реагувати з аміногрупою, широко застосовуються в біоогранічній хімії для конюгації. Солі пірилію до наших досліджень з цією метою не використовувались.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках державної бюджетної теми “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” № 2.2.4.16 за 1997-99 р. ( № держ. реєстрації: 0197U004292), а також в рамках спільного міжнародного проекту Інституту молекулярної біології і генетики НАН України та Ліверморської національної лабораторії Каліфорнійського університету (Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, USA) за програмою ІРР Міністерства енергетики США, реєстраційний номер В507077.

Мета роботи полягала в розробці нового синтетичного методу для конюгації пірилоціанінів з біомолекулами, в синтезі та дослідженні спектрально-люмінесцентних властивостей модельних конюгатів ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

  • провести реакцію пірилоціанінів з аліфатичними амінами в таких умовах, в яких не руйнується більшість біомолекул;
  • дослідити кінетику реакції пірилоціанінів  з низкою амінокислот, вивчити вплив природи амінокислоти, температури, лужності середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції;
  • дослідити можливі побічні реакції з іншими функціональними групами (ФГ) біомолекул;
  • вивчити вплив природи ціанінових барвників та замісників у пірилієвому циклі на перебіг реакції конюгації;
  • синтезувати модельні конюгати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, дослідити їхні спектрально-люмінесцентні властивості у вільному стані та при взаємодії з біомолекулами.

Обєкт дослідження пірило- та піридоціаніни, конюгати піридоціанінів з амінокислотами, білками та синтетичними аміноалкілолігонуклеотидами.

Предмет дослідження реакція пірилоціанінів з амінами в мяких умовах, застосування цієї реакції для ситезу конюгатів піридоціанінів з біомолекулами.

Методи дослідження хімічний синтез, УФ та видима електронна спектроскопія, флуоресцентна спектроскопія, тонкошарова, високоефективна рідинна та газова хроматографія, хроматомасспектрометричний аналіз, гель-фільтрація та електрофоретичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше застосовано реакцію  пірилоціанінів з аліфатичними амінами для ковалентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів та білків. Досліджено вплив природи амінокомпоненти, температури, рН середовища, природи буфера та розчинника на перебіг реакції мічення білків та аміноалкілолігонуклеотидів. Вивчено вплив природи ціанінових барвників та замісників у пірилієвому циклі на перебіг реакції конюгації, досліджено взаємодію пірилоціанінів з іншими ФГ біомолекул. Синтезовано низку модельних конюгатів піридоціанінів з олігонуклеотидами та білками, досліджено їхні спектрально-люмінесцентні властивості.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено і запропоновано для практичного використання зручний метод конюгації пірилоціанінів з біомолекулами. Інститут молекулярної біології і генетики та фірма Fluorescent BioProbes GmbH підписали контракт та подали заявку на патент “Verfahren und Verbindungen zur Fluoreszenzmarkierung von Biomolekulen und Polymer-Partikeln” (Ger. Appl. 101.53.818.9 (05. Nov. 2001)) на спільне комерційне використання реакції пірилієвих солей та описаних пірилоціанінів для конюгації флуорофорів з аміногрупою біомолекул.

Особистий внесок здобувача. Основний обєм експериментальної роботи, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані пошукувачем одноосібно. Автором особисто досліджено кінетику взаємодії пірилоціанінів з амінокислотами, запропоновано оптимальні умови проведення реакції для різних пірилоціанінів, інтерпретовано результати хроматографічних та хроматомасспектрометричних аналізів, синтезовано, виділено та охарактеризовано олігонуклеотидні та пептидні конюгати піридоціанінів. Частину спектральних досліджень та ПЛР проведено у співпраці з  Дмітрієвою С.Ю., Дубеєм І.Я., Дмитренко В.В., Ковальською В.Б. та Лосицьким М.Ю. Постановка задачі та обговорення результатів проведені з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на Міжнародній конференції з органічної хімії (Харків, 1995),  8 Європейській конференції з спектроскопії біологічних молекул (Голландія, Еншеде, 1999), XV Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2000), 3 Хорватській конференції з біотехнології та навколишнього середовища (Хорватія, Загреб, 2001), VII Конференції з методів та застосування флуоресцентної спектроскопії (Голландія, Амстердам, 2001), а також на наукових семінарах відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. Основний зміст роботи відображено у 6 статтях в наукових фахових журналах та 7 тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 154 сторінках друкованого тексту. Вона складається із вступу, основної частини (огляд літератури, матеріали і методи, обговорення результатів) та підсумкових висновків. Перелік цитованої літератури налічує 109 найменувань. Робота містить 53 рисунки та 12 таблиць.


ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


У першому  розділі розглянуто методи конюгації молекул-зондів з аміногрупою біомолекул. Як правило, такі молекули містять амінореактивні ацилюючі групи, які утворюють аміди, сульфаміди, сечовини або тіосечовини в результаті реакції з амінами. Використовуються також реакції алкілування та відновлювального алкілування аміногрупи біомолекули для конюгації з зондами. Співставлено переваги та недоліки відомих методів конюгації.

Детально розглянуто ціанінові барвники, які використовуються для ковалентного мічення олігонуклеотидів, НК та білків. Показано, що ціанінові барвники набувають дедалі більшого поширення як флуоресцентні мітки біомолекул.

       Наведено огляд літератури про механізм реакції солей пірилію з первинними амінами, акцентовано увагу на можливих побічних реакціях. Окремо розглянуто реакцію пірилоціанінів з амінами.

       У  другому розділі наведено методики проведення реакції пірилоціанінів з амінокислотами, синтезу конюгатів піридоціанінів з олігонуклеотидами та пептидами. Описано процедури виділення та аналізу синтезованих речовин, дослідження їх спектральних властивостей.

       У третьому розділі подано результати експериментальних досліджень та їхнє обговорення.

Дослідження реакції пірилоціанінів з амінами. Реакція пірилієвих ціанінових барвників з первинними амінами є одним із добре відомих методів отримання піридинієвих ціанінових барвників, однак жорсткі умови її проведення абсолютно не прийнятні для мічення біологічних обєктів (рис. 1).


       

Рис. 1. Реакція пірилоціаніну Cyan39 з амінами.


Для розробки мяких умов проведення реакції була застосована 6-аміногексанова (Аср) кислота як модельна амінокомпонента. Її аміногрупа схожа за хімічними властивостями як на аміногрупу аміноалкілмодифікованих олігонуклеотидів, так і на ε-аміногрупу лізину, по якій, як правило, модифікуються пептиди та білки. У якості буферів для проведення реакції було застосовано натрійкарбонат-бікарбонатний та триетиламонійацетатний (ТЕАА) буфери. Вони не містять катіонів амонію і первинних та вторинних аміногруп, які можуть реагувати із солями пірилію. Наявність оцтової кислоти у триетиламонійацетатному буфері, згідно з літературними даними, повинна сприяти циклізації проміжного нециклічного продукту реакції.

Реакція досліджувалася при молярному співвідношенні 6-аміногексанової кислоти та Cyan39 1:1. Для реальної конюгації краще брати надлишок барвника, але при спостереженні за перебігом реакції за зміною електронного спектру поглинання надлишок пірилієвого барвника маскував би перехід Cyan39Cyan40 (рис.2).


Рис. 2. Електронні спектри поглинання барвників Cyan39 та Cyan40.


У результаті проведених досліджень було встановлено, що кон<