Диссертации и авторефераты Украины
Перейти на каталог
Каталог авторефератов

Я ищу:
Диссертация / Автореферат

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua
Тема автореферата диссертации: Дизайн флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників для нуклеїнових кислот та білків 2005 года.
Источник: Автореф. дис... д-ра хім. наук: 02.00.10 / С.М. Ярмолюк; Ін-т біоорган. хімії та нафтохімії. — К., 2005. — 35 с. — укp.
Аннотация: Досліджено питання дизайну флуоресцентних зондів на підставі ціанінових барвників. Запропоновано напівінтеркаляційну модель взаємодії монометинціанінів з дволанцюговою ДНК, згідно з якою менш основний гетороцикл барвника "інтеркалює" між парами основ, а гетероцикл з більшою основністю фіксується в малій борозенці ДНК. Охарактеризовано принцип ефекторних груп, що дає змогу на підставі відомих люміофорів створювати нові флуоресцентні зонди для детекції нуклеїнових кислот (НК) і білків. Синтезовано та вивчено спектрально-люмінесцентні властивості ряду гомодимерних і гомотримерних монометинціанінів у присутності НК і білків. Показано, що триметинціаніни з алкільними замісниками в поліметиновому ланцюзі э ефективними флуоресцентними зондами для гомогенного визначення ДНК у розчинах й агарозних гелях. Розроблено технологію провідного барвника в контексті дизайну нових флуоресцентних зондів.

Текст работы:

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ


ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ





Ярмолюк Сергій Миколайович




УДК 577.366+57.08.088.5+542.95




ДИЗАЙН ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ ЗОНДІВ

НА ОСНОВІ ЦІАНІНОВИХ БАРВНИКІВ для нуклеїнових кислот та білків




02.00.10 біоорганічна хімія





АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора хімічних наук






КИЇВ 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії біологічно активних речовин Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.


Захист дисертації відбудеться 10 червня 2005 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України за адресою: 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.


З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 6 травня 2005 року.


Учений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                        Д. М. Федоряк


Загальна характеристика роботи


Актуальність теми. Стрімкий розвиток біотехнологій потребує швидких і зручних засобів детекції та візуалізації нуклеїнових кислот (НК) і білків. Радіоізотопи, які традиційно використовуються з цією метою, мають ряд суттєвих недоліків, серед яких висока вартість, нестабільність, небезпечні умови праці. Тому на заміну радіоактивним міткам приходять більш зручні й дешеві імунохімічні та спектрально-люмінесцентні методи.

Більшість ультрачутливих методів кількісного та якісного визначення НК ґрунтується на застосуванні ціанінових барвників. Так, зокрема, їх використовують для визначення НК у розчинах, електрофоретичних гелях, на твердих носіях (блоти та мікрочіпи), у капілярно-електрофоретичних процедурах, флуоресцентній мікроскопії, Real-time PCR (полімеразно-ланцюгова реакція з постійним визначенням вмісту НК). Визначення НК у розчинах з допомогою SYBR Green забезпечує чутливість у 10000 разів вищу, ніж при спектроскопії поглинання, та в 400 разів вищу, ніж при використанні бромистого етидію.

Ціанінові барвники застосовуються також для ковалентного або нековалентного мічення білків. Так, в імунохімічних діагностиках використовують індоленінтриметинові (Cy3) та індоленінпентаметинові (Cy5) барвники. Індоленінові й скварилеві барвники застосовують для нековалентного мічення імуноглобулінів та у FISH (флуоресцентна гібридизація in-situ).

На відміну від радіоізотопів, флуоресцентні зонди безпечні у використанні та стабільні при зберіганні. Застосування сучасного спектрального обладнання, зокрема лазерів, дає змогу досягати чутливості детекції, сумірної з радіоізотопними методами. Так, наприклад, флуоресцентна технологія SMD (single molecule detection) дозволяє зафіксувати в розчині навіть окремі молекули.

Нині ціанінові барвники посідають чільне місце серед найперспективніших флуоресцентних зондів для біополімерів. Проте спектрально-люмінесцентні властивості поліметинових барвників у присутності біополімерів були практично не досліджені, запропоновані моделі їхньої взаємодії з НК не завжди давали змогу пояснити одержані експериментальні дані. Не вивчався також вплив агрегації на флуоресцентні властивості ціанінів у присутності біополімерів, не існувало практичних рекомендацій, розроблених технологій для дизайну нових флуоресцентних зондів.

Вирішенню зазначених актуальних проблем і присвячена дисертаційна робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною планових наукових досліджень, що виконувались у рамках держбюджетних тем “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” № 2.2.4.16 (19971999 рр.) (№ державної реєстрації 0197U004292), “Синтез флуоресцентних гомо-n-мерних ціанінових барвників та вивчення механізму їх взаємодії з нуклеїновими кислотами” № 2.2.4.16 (20002002 рр.) (№ державної реєстрації 0100U000792), “Синтез мезо-заміщених в поліметиновому ланцюгу триметинціанів та вивчення механізму їхньої взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками” № 2.2.4.16 (20032007 рр.) (№ державної реєстрації 0103U000070) та в рамках міжнародного проекту ІРР Міністерства енергетики США (№ В507077) (20002001 рр.). У 2004 році робота була підтримана міжнародним науковим фондом УНТЦ.

Мета дослідження полягала в спрямованому конструюванні (дизайні) флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників та вивченні їх взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками.

Для досягнення цієї мети необхідно було розвязати такі завдання:

  • провести спектрально-люмінесцентне дослідження великого масиву поліметинових барвників різної природи для зясування загальних закономірностей їхніх властивостей у присутності НК і білків;
  • розробити нові методи синтезу гомо-n-мерних монометинціанінів та триметинціанінів із замісниками в поліметиновому ланцюзі і дослідити спектрально-люмінесцентні властивості їхніх комплексів з нуклеїновими кислотами;
  • вивчити агрегацію гомо-n-мерних монометинціанінів у вільному стані й у присутності біополімерів;
  • розробити новий метод ковалентної конюгації флуоресцентних ціанінових барвників до біомолекул на основі реакції пірилоціанінів з аліфатичними амінами;
  • розробити технологію спрямованого конструювання флуоресцентних зондів для гомогенних систем детекції біополімерів.

Обєкт дослідження ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для біополімерів.

Предмет дослідження дизайн флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників для НК та білків.

Методи дослідження: органічний синтез, електронна спектроскопія поглинання та випромінювання, квантово-хімічні розрахунки, гель-електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано нові методи синтезу             гомо-n-мерних монометинціанінових барвників. Уперше синтезовано гомотримерний ціаніновий барвник. Вивчено спектрально-люмінесцентні властивості барвників у вільному стані та в присутності НК і білків.

Триметинціаніни з модифікованим поліметиновим ланцюгом уперше запропоновано для детекції НК у гомогенному аналізі. Показано, що основним способом їх взаємодії з ДНК є інтеркаляція. Розроблено новий зручний метод С-ацилювання активних метиленових груп імідазолідами карбонових кислот з використанням активуючого агента N,N-карбонілдіімідазолу (КДІ).

Запропоновано й експериментально реалізовано принцип ефекторних груп, що дає змогу регулювати специфічність звязування флуоресцентних зондів з біополімерами. Розроблено зручні методи синтезу монометинціанінів з ефекторними групами різної природи та вивчено вплив цих груп на спектральні властивості утворених комплексів барвників з біополімерами.

На основі проведених спектрально-люмінесцентних досліджень і компютерних розрахунків запропоновано модель “напівінтеркаляції” монометинціанінових барвників у дволанцюгову ДНК, згідно з якою один гетероцикл молекули інтеркалює між сусідніми парами основ, тоді як інший просторово фіксується в маленькій борозенці НК.

За допомогою спектрально-люмінесцентних методів досліджено агрегаційні процеси    гомо-n-мерних барвників і барвників з ефекторними групами у вільному стані та в присутності біополімерів. Показано, що висока чутливість детекції НК гомодимерними барвниками зумовлена процесами агрегації ціанінів.

Уперше застосовано реакцію пірилоціанінів з аліфатичними амінами для ковалентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів і білків.

Розроблено основні принципи дизайну флуоресцентних зондів для гомогенної детекції біополімерів, що лежать в основі технології “провідного барвника”.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена технологія провідного барвника вперше була використана в контрактах між Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України та фірмою „Fluka GmbH” (Швейцарія). У результаті спільного дворічного дослідження (20022003 рр.) розроблено декілька нових комерційних флуоресцентних зондів для детекції білків. У 2003 р. зазначені установи уклали нову угоду про дизайн флуоресцентних зондів для візуалізації нуклеїнових кислот у гелях.

У 2002 р. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України та фірма “Fluorescent BioProbes GmbH” (Німеччина) уклали контракт та взяли патент на спільне комерційне використання реакції пірилоціанінів з амінами для конюгації флуорофорів з аміногрупою біомолекул.

Особистий внесок здобувача є визначальним на всіх етапах дослідження і полягає в загальній постановці завдання, у виборі обєктів дослідження, аналізі, інтерпретації та узагальненні експериментальних даних, одержаних як самостійно, так і у співпраці з іншими дослідниками. Під керівництвом автора виконані й захищені кандидатські дисертації аспірантів і пошукувачів В.Б. Ковальської (2000 р.), Д.В. Криворотенка (2001 р.), І.О. Кочешева (2001 р.), С.С. Лукашова (2003 р.) та О.М. Костенка (2003 р.). Автор висловлює щиру подяку О.І. Толмачову, Ю.Л. Сломінському, В.М. Ящуку, О.І. Корнелюку та Д.М. Говоруну за постійну підтримку і взаємокорисне обговорення отриманих результатів; І.В. Алексєєвій та Г.Х. Мацуці першим учителям і науковим керівникам, Г.В. Єльській науковому консультанту.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на ХVІІІ, ХІХ, ХХ Українських конференціях з органічної хімії (Дніпропетровськ, 1998; Львів, 2001; Одеса, 2004), Міжнародній конференції “Фізика і хімія органічних люмінофорів 95” (Харків, 1995); ХІІ International Round Table “Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications” (La Jolla, USA, 1996); Vth International Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy (Berlin, Germany, 1997); 8th European Conference of Spectroscopy Biological Molecules (Enschede, Netherlands, 1999); Міжнародній конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2000); Scientific conference “Biotechnology and Environment 2001” (Zagreb, Croatia, 2001); 7th Conference on Methods and Application of Fluorescence (Amsterdam, The Netherland, 2001); Fifth International Simposium on Functional р-Electron Systems (Ulm/Neu-Ulm, Germany, 2002); 4-й Міжнародній конференції по електронних процесах в органічних матеріалах (Львів, 2002); The Inaugural Austral-Asian Biospectroscopy Conference (Nakhon Ratchasima, Thailand, 2003); Meeting of the Discussion Group of the Royal Society of Chemistry “Fris 2003 Fast Reactions in Solution” (Halle, 2003); Міжнародному форумі “Україна і Польща разом у наукових програмах Європейського Союзу” (Львів, 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 50 статтях у наукових фахових виданнях, 45 тезах доповідей на наукових конференціях, одному міжнародному патенті.

Cтруктура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, семи розділів, висновків і списку використаних джерел, що налічує 290 найменувань.

Робота містить 14 схем, 50 таблиць і 117 рисунків. Повний обсяг роботи 342 сторінок.


ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


У результаті аналізу хімічних структур усіх комерційно доступних ціанінових барвників, що застосовуються для візуалізації НК у гелях, нами виявлено досить принципові спільні для всіх барвників структурні закономірності (рис. 1).


Рис. 1. Хімічна структура “оптимального” барвника для визначення НК у гомогенному аналізі


Як правило, для визначення НК у гелях і розчинах використовуються несиметричні монометинціанінові барвники, причому їх менш основне гетероциклічне ядро (А, бензазольне) містить мінімум замісників, а більш основне (Б, піридинове або хінолінове) досить обємні замісники.

Слід зазначити, що майже в усіх опублікованих роботах взаємодія поліметинових барвників з НК досліджена на двох-трьох барвниках (YO, TO та їх похідних). У повному обсязі залежність спектрально-люмінесцентних властивостей утворених комплексів від хімічної структури барвника не вивчалася.

Загалом нами досліджено спектрально-люмінесцентні властивості близько 300 різних за хімічною природою ціанінових барвників у присутності НК і білків з метою зясування загальних закономірностей їхньої взаємодії з цими біополімерами.

Для зменшення агрегації ціанінів і покращення їх розчинності у воді молекула барвника модифікується сульфогрупами або залишками фосфорної кислоти. Присутність у складі молекули барвників Cyan 1, Cyan 5, Cyan 12 (табл. 1) аніонних груп призводить до різкого погіршення флуоресцентних властивостей барвників як зондів для детекції НК.


Таблиця 1

Інтенсивність флуоресценції комплексів деяких бензтіазольних барвників з ДНК

Примітка. IDNA інтенсивність флуоресценції барвника в присутності ДНК, ΔDQDNA приріст інтенсивності флуоресценції при звязуванні з ДНК.


Оскільки барвник Cyan 3 показав найбільше зростання інтенсивності флуоресценції при взаємодії з ДНК, ми синтезували низку монометинціанінів з 5,6-(метилендіокси)бензтіазольним фрагментом та іншими алкоксильними залишками. Спектральні характеристики барвників групи Cyan МО у присутності ДНК наведено в табл. 2.


Таблиця 2

Характеристики спектрів поглинання та флуоресценції барвників групи Cyan МО у присутності ДНК

Примітка. , довжина хвилі максимуму спектра поглинання та випромінювання барвника в присутності ДНК.

Усі барвники досить суттєво збільшують інтенсивність флуоресценції у присутності ДНК   (ΔDQDNA = 21,4104). Нами досліджено вплив довжини N-алкільного замісника бензтіазольного ядра (Cyan 3, Cyan 13 та Cyan 23) на спектральні властивості барвників у комплексах з ДНК. Збільшення довжини замісника погіршує властивості барвника як флуоресцентного зонда. Зокрема, у випадку Cyan 23 (R = C4H9) IDNA = 22,9 у.о., тоді як для Cyan 13 (R = CH3) IDNA = 49,9 у.о. (табл. 1, 2). Інтенсивність флуоресценції Cyan 15 з обємним залишком 15-краун-5 також зростає при додаванні ДНК і перевищує інтенсивність випромінювання незаміщеного Cyan 45 (табл. 2). Цей факт складно пояснити з допомогою класичної моделі інтеркаляції, яка передбачає вбудовування всієї молекули барвника в міжосновний простір ДНК.

Вивчення механізму взаємодії монометинціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Загальновизнано, що інтеркаляція є основним механізмом взаємодії монометинціанінів з НК. При великих співвідношеннях барвник/ДНК можливе також звязування з маленькою борозенкою. Проведені нами дослідження комплексів поліметинціанінів з НК свідчать про те, що характер такої взаємодії досить складний і визначається співвідношенням барвник/кількість пар основ НК, природою барвника і типом НК.

У ході дослідження нами вивчено низку монометинціанінів з гетероциклічним ядром      5,6-(метилендіокси)бензтіазолу (M42, Cyan 13, M44, M45, M47) з метою зясування впливу замісників на їхню взаємодію з ДНК. Спектрально-люмінесцентні властивості барвників у вільному стані та в присутності НК порівняно з характеристиками відповідних барвників з незаміщеним залишком бензтіазолу (M41, Cyan 45, BO, TO, Cyan 40) подано у табл. 3.

Уведення замісників до гетероциклічних ядер з різною електронодонорною здатністю по-різному впливає на флуоресцентні властивості ДНК-комплексів несиметричних монометинціанінів (табл. 3). Замісники в менш електронозбагаченому гетерозалишку значно знижують рівень інтенсивності флуоресценції барвника в ДНК-комплексі (IDNA у BO < M44, M47 < Cyan 40, M45 < TO), тоді як заміщення в більш електроно-збагаченому, навпаки, збільшує інтенсивність флуоресценції (IDNA у M42 > M41, Cyan 13 > Cyan 45, Cyan 40 > BO, M47 > M 44). Ця закономірність може свідчити про те, що в міжосновний простір ДНК повністю інтеркалює лише один з гетерозалишків. Електронна густина в молекулі несиметричного монометинціаніну дещо зсунута до більш електронозбагаченого залишку, піридинового, хінолінового чи метилендіоксибензтіазольного. Очевидно, при утворенні комплексу з ДНК барвник орієнтується так, що більш основний гетерозалишок розташовується ближче до негативно зарядженої фосфатної групи, а в електронейтральний міжосновний простір занурюється менш електронозбагачений залишок.

Для дослідження електронної асиметрії молекули барвника при утворенні комплексів монометинціанінів з ДНК синтезовано ряд пірилієвих та відповідних ізоструктурних піридинових барвників.

У присутності ДНК інтенсивність випромінювання всіх барвників IDNA зростає (табл. 4), проте величина ΔDQDNA значно більша для піридинових барвників (61,4182), ніж для пірилієвих (5,617,9). Барвники М51 і М53 з великими обємними фенільними радикалами мають досить велике значення ΔDQDNA = 71,6 та 25,3 відповідно.

Таблиця 3

Інтенсивність флуоресценції ДНК-комплексів

метилендіоксибензтіазольних барвників та їх незаміщених аналогів


Таблиця 4

Спектрально-люмінесцентні властивості барвників М46М53

у вільному стані та в присутності ДНК

Продовж. табл. 4

Примітка. ΔS0 стоксів зсув вільного барвника у буфері.


Якщо молекула барвника звязується з борозенкою НК, то заряджені фосфатні групи та гідратна оболонка рівномірно розташовані уздовж молекули барвника. При неповній інтеркаляції молекула барвника опиняється в електрично неоднорідному мікросередовищі, оскільки один гетерозалишок барвника розташовано в гідрофобному міжосновному просторі, а інший біля негативного заряду фосфатів (рис. 2).



Рис. 2. Молекула Cyan 40 (світло-сіра), вкладена між парами основ

динуклеотиду dСdT/dAdG. Бензтіазольне ядро перекрите парами основ

(гідрофобний простір), а піридинове видається в малу борозенку (полярне середовище)

Унаслідок такого розташування при напівінтеркаляції зарядова густина барвника повинна зсуватися на гетероциклічне ядро, яке видається з гідрофобної кишені. При збільшенні електронної асиметрії в молекулі монометинціаніну стоксів зсув ΔS у нього буде зростати.

Величини стоксових зсувів при утворенні комплексу з ДНК зростають у піридинових барвників Cyan 40, М48, М49, М51 і М53, у яких, очевидно, саме піридинове ядро знаходиться назовні. У пірилієвих барвників Cyan 39, М46, М50 і М53 стоксів зсув зменшується при взаємодії з ДНК. На нашу думку, ці барвники розташовуються в НК-комплексах подібно до піридинових, оскільки напрямок розподілення електронної асиметрії для пірилієвих і піридинових барвників протилежний.

Для зясування механізму взаємодії монометинціанінів з ДНК ми дослідили також вплив полярності середовища на флуоресцентні властивості комплексів барвників з ДНК. У робочі розчини додавали 15 %-у домішку органічного розчинника, який добре змішується з водою. Для порівняння використовували відомий класичний неціаніновий інтеркалятор бромистий етидій EtBr (табл. 5).


Таблиця 5

Інтенсивність випромінювання Cyan 13 та EtBr у вільному стані

та в комплексі з ДНК  в присутності 15 %-ї домішки органічного розчинника


Для бромистого етидію зменшення інтенсивності флуоресценції комплексів барвникДНК при додаванні органічних розчинників є незначним  (2229 %) і майже не залежить від природи домішки. Цього й можна було очікувати, зважаючи на інтеркаляційний механізм взаємодії бромистого етидію з ДНК.

Для монометинціаніну зменшення інтенсивності флуоресценції комплексів барвникДНК при додаванні органічних розчинників проявляється яскравіше і становить 1677 %. На наш погляд, інтеркаляційна модель взаємодії ціанінових барвників з ДНК не може цього пояснити. Можливим поясненням цього ефекту може бути запропонований механізм часткової інтеркаляції барвника в ДНК, при якому молекула барвника стає більш “відкритою” для взаємодії з середовищем.

Інтеркаляційний характер фіксації молекул бензтіазольного монометинціаніну Cyan 40 (табл. 3) на длДНК підтверджено за допомогою спектрів лінійного дихроїзму (рис. 3). Про це свідчать відємні величини LD та LDr.

Проведене нами математичне моделювання механізму взаємодії монометинціаніну Cyan 40 з дволанцюговою ДНК з допомогою програми Hyperchem 5.0 показало, що найбільш енергетично вигідним є механізм повної інтеркаляції. Отримані дані не суперечать експериментальним результатам  напівінтеркаляційної взаємодії Cyan 40 з ДНК.

У випадку існування ряду додаткових факторів утворення агрегату між вільною та інтеркальованою молекулами Cyan 40 (коли вільна молекула, розташовуючись у борозенці ДНК, взаємодіє з інтеркальованою) чи введення до молекули барвника обємних замісників енергетична вигідність різних механізмів звязування може змінитись на користь напівінтеркаляції (рис. 4).



Рис. 4. Структура комплексу барвника Cyan 40 з ДНК. Бензтіазольне ядро інтеркалює

між парами основ, а піридинове знаходиться в малій борозенці

       Процеси агрегації, що супроводжують взаємодію поліметинціанінів з біополімерами, здебільшого ігнорувались і практично не вивчались до наших досліджень.

У спектрі поглинання Cyan13 спостерігається мономерна смуга (λmax = 440 нм), агрегатні смуги І (λmax = 417 нм) та ІІ (λmax = 395 нм). Остання смуга зявляється лише при наявності ДНК у розчині (рис. 5). На наш погляд, утворення агрегатів ІІ за участю молекул ДНК може свідчити на користь напівінтеркаляційної моделі взаємодії. Можливо, частина молекули звязаного барвника, що видається з міжосновного простору, є матрицею, на якій утворюється агрегат ІІ.

На основі отриманих експериментальних даних нами запропоновано напівінтеркаляційну модель взаємодії ціанінових барвників з дволанцюговою ДНК: при утворенні комплексу з длДНК монометинціанін розташовується так, що один з його гетероциклічних залишків занурюється в електронейтральний міжосновний простір, а інший електростатично взаємодіє з фосфатною групою вуглеводневого каркасу.

Ціанінові барвники з ефекторними групами як флуоресцентні зонди для нуклеїнових кислот та білків. Для збільшення стійкості комплексу барвникбіополімер чи надання барвникові специфічності звязування до певного біополімеру ми запропонували уводити до молекул барвників “ефекторні групи” ковалентно приєднані до хромофора функціональні замісники, які взаємодіють з біополімером, не впливаючи на спектральні властивості хромофора.

Для вивчення залежності афінних і спектральних властивостей модифікованих барвників від природи ефекторної групи нами було запропоновано ряд простих методів продукування множини ціанінових барвників з різноманітними функціональними замісниками. Як модельний хромофор використовувався високофлуоресцентний барвник Cyan 40, для модифікації якого ефекторними групами застосовано реакцію пірилоціаніну Cyan 39 з амінами (схема 1), досліджено її перебіг з різними функціонально заміщеними амінами та діамінами.

Для синтезу барвників з ефекторними групами ми вперше застосували поширений у пептидній хімії реагент карбонілдіімідазол (КДІ). У цьому разі індольний азот і спиртові групи амінокомпонент не потребують використання захисних груп (сполуки D-16, D-19, схема 2).



Схема 1. Синтез похідних Cyan 40 реакцією пірилоціаніну Cyan 39 з первинними амінами



Схема 2. Синтез похідних Cyan 40 з ефекторними групами

активацією карбоксильної групи із застосуванням КДІ


Для кислот, хлорангідриди яких важкодоступні, ацилювання барвника D-23 проведено з допомогою КДІ. Барвники Р-2, Р-4, Р-5, Р-6, Р-7, Р-8 отримано саме у такий спосіб. Р-1, Р-3, Р-10, Р-11 синтезовано ацилюванням D-23 хлорангідридами карбонових кислот у піридині (схема 3).




Схема 3. Синтез похідних Cyan 40 з ефекторними групами

ацилюванням аміногрупи ціанінового барвника D23

Слід зазначити, що спектрально-люмінесцентні властивості вільних барвників з ефекторними групами майже не відрізняються від властивостей базового немодифікованого барвника Cyan 40.

Нами вперше показано, що присутність гідроксильної групи в молекулі ціанінів D-6, D-9,    D-19 значно підвищує інтенсивність випромінювання їх комплексів з ДНК. Амінні ефекторні групи практично не впливають на флуоресцентні властивості барвників як у вільному стані, так і в присутності ДНК, РНК і білків (D-3, D-5, D-11, D-6, D-12, D-13, D-6, D-9, D-18, D-24, D-27) (табл. 6).


Таблиця 6

Характеристики спектрів флуоресценції барвників

з ефекторними групами D-1D-27 у розчині та в присутності ДНК і РНК

Примітка. I0, IDNA, IRNA інтенсивність флуоресценції барвника у вільному стані та в присутності ДНК і РНК.


Принцип ефекторних груп також реалізовано для конструювання флуоресцентних зондів для детекції білків. Барвники Р-4 та Р-5 при звязуванні з BSA підвищують інтенсивність флуоресценції на два порядки (табл. 7). Можливо, цей ефект повязаний з фрагментом аніліду арилоцтової кислоти ефектора, який надає барвнику здатності специфічно локалізуватись в одному з центрів звязування BSA.


Таблиця 7

Флуоресцентні властивості барвників Р-1Р-8, Р-10Р-11 у присутності 0,1 мг/мл BSA

Примітка. IBSA інтенсивність флуоресценції барвника в присутності БСА, ΔDQBSA    приріст флуоресценції при звязуванні.


Отже, запропонований нами принцип ефекторних груп відкриває широкі можливості для створення нових флуоресцентних зондів на основі вже відомих ціанінових барвників. Завдяки модифікації одного й того ж ціаніну з допомогою різних ефекторів можна створювати флуоресцентні зонди зі специфічністю до ДНК, РНК чи білка, надавати барвнику здатності проникати через біологічні мембрани, синтезувати більш складні зонди з переносом енергії.

Гомо-n-мерні монометинові ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції нуклеїнових кислот. Основна увага при вивченні властивостей комплексів гомодимерДНК приділялась особливостям будови та природи інтеркалятора. До наших досліджень в літературі не існувало цілісного уявлення про вплив жорсткості, хімічного складу лінкера на властивості комплексу. Отже, пошук нових хімічних підходів для отримання гомодимерних монометинціанінів, лінкери яких суттєво б відрізнялися за хімічним складом та будовою, стало одним з предметів нашого дослідження. Ми використали три нових підходи, які дали змогу отримати ряд гомо-n-мерних тіапіридоціанів з лінкерами, різними за складом і довжиною.

Перший підхід полягав у застосуванні реакції пірилієвих солей з первинними діамінами (схема 4).




Схема 4. Синтез гомодимерних тіапіридоціанінів реакцією

пірилієвих солей з первинними діамінами


Страница: 1  Страница: 2  Страница: 3 

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua


Меню
Реклама



2006-2009 © Диссертации и авторефераты Украины