Диссертации и авторефераты Украины
Перейти на каталог
Каталог авторефератов

Я ищу:
Диссертация / Автореферат

По вопросу доставки диссертации по этой теме пишите на электронный адрес: info@disser.com.ua
Тема автореферата диссертации: Застосування молекулярно-генетичних маркерів різних класів при визначенні внутрішньо- та міжпородної мінливості свиней 2001 года.
Источник: Автореф. дис... канд. с.-г. наук: 03.00.15 / О.І. Метлицька; УААН. Ін-т розведення і генетики тварин. — с.Чубинське (Київська обл.), 2001. — 20 с. — укp.
Аннотация: Створено технології типування свиней за геном гормону росту і ріанодин-рецепторним геном та охарактеризовано вітчизняні породи свиней за цими локусами. Встановлено зв'язок генотипів RYR1-гена з життєздатністю поросят раннього віку. Досліджено мікросателітні локуси ДНК свиней полтавської м'ясної та миргородської порід. Модифіковано метод виділення ДНК з м'язової тканини свиней. Оцінено генетичну диференціацію полтавської м'ясної породи та порід-засновників, ступінь внеску кожної з них у формування її генетичної структури з застосуванням імуногенетичних маркерів і статистико-математичних моделей. Розглянуто мікроеволюційні процеси в генофондному стаді миргородської породи свиней. Проведено зіставлення генетичної інформативності систем мікросателітних маркерів із традиційними імуногенетичними.

Текст работы:

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН 

МЕТЛИЦЬКА  Олена Іванівна

УДК 636.082. 12:575.1/.2

ЗАСТОСУВАННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МАРКЕРІВ РІЗНИХ КЛАСІВ ПРИ ВИЗНАЧЕННІ ВНУТРІШНЬО- ТА МІЖПОРОДНОЇ МІНЛИВОСТІ СВИНЕЙ

03.00.15 - генетика

  А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук



с.Чубинське  Київської області - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті свинарства ім.Квасницького Української академії аграрних наук

Науковий керiвник:  кандидат біологічних наук,

       старший науковий співробітник

       Балацький Віктор Миколайович,

       завідувач лабораторії генетики

       Інститут свинарства УААН.

Офiцiйнi опоненти: доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник,

Подоба Борис Євгенович,

завідувач лабораторії генетичних основ селекції

Інституту розведення і генетики тварин УААН


кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Бердичевський Микола Степанович,

завідувач лабораторії розведення і генетики

сільськогосподарських тварин Інституту біології тварин


Провiдна установа Інститут тваринництва УААН, лабораторія генетики, м.Харків, п/в Кулиничі




Захист відбудеться "30"  жовтня  2001 р.

о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01     при Інституті розведення і генетики тварин УААН, за адресою: вул.Погребняка, 1, с.Чубинське, Бориспільського району, Київської області, 08321.


З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН, за адресою: вул.Погребняка,1, с.Чубинське, Бориспільського району, Київської області, 08321.

Автореферат розісланий " 28"  веересня   2001 р.



Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

       Мільченко Ю.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин, як правило, досягається використанням таких традиційних методів селекції і розведення як оцінка за фенотипом, конституційно-екстер'єрними показниками, якістю потомства, репродуктивними функціями. Сучасні системи розведення, насамперед, спрямовані на отримання потомства від високопродуктивних представників породи, які відрізняються високим виходом продукції, тому аналіз їх геному є вельми важливою складовою племінної роботи. Великомасштабна селекція, широке застосування штучного осіменіння з використанням імпортних тварин без урахування їх адаптивних властивостей, поряд з очевидною економічною ефективністю, приводить до скорочення чисельності локальних порід і повної втрати притаманних їм унікальних алелів, небажаному поширенню в популяціях сільськогосподарських тварин генів-носіїв спадкових аномалій. В той же час, у зв'язку з цим існує необхідність детального аналізу геному високопродуктивних особин, пошуку оптимального балансу генів, які визначають продуктивні якості тварин і їх біологічні особливості із залученням сучасних методів його дослідження. При аналізі геному і установленні закономірностей формування генотипів з бажаним комплексом ознак першочергова роль має належати молекулярно-генетичним маркерам [Машуров А.М., 1991; Сулімова П.Н., 1993; Прохоренко П.Н., 1996; Подоба Б.Є., 1997; Почерняєв К.Ф., 1997]. 

На сучасному етапі, найбільш інформативними маркерами є молекулярно-генетичні системи, що базуються на визначенні поліморфних послідовностей ДНК. Розвиток методів аналізу поліморфізму ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції відкриває перед дослідниками великі можливості не тільки щодо встановлення фундаментальних закономірностей формування генофонду в процесі спрямованого відбору, а також для вирішення прикладних задач селекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно тематики науково-дослідної роботи лабораторії генетики інституту свинарства УААН : "Розробити нові молекулярно-генетичні методи оцінки генотипів свиней для прискорення селекційного процесу в свинарстві" (N держреєстрації 0197 U 003280).

Мета і задачі роботи. Метою даної роботи є комплексне використання генетичних маркерів  для дослідження  генетичної структури  популяцій, що селекціонуються та оцінки генотипів свиней різного напряму продуктивності.

Для досягнення цієї мети вирішувався ряд конкретних задач:

1.Дослідити поліморфізм  гена гормона роста та ріанодин-рецепторного гена, які обумовлюють прояв важливих біологічних і продуктивних якостей  свиней:

-розробити техніку виявлення  алелів  вказаних генів

-отримати окремі генетико-популяційні параметри для стад свиней вітчизняної селекції

-провести пошук зв'язків генотипів за цими генами з окремими показниками продуктивності.

2.Оптимізувати умови вивчення двох систем мікросателітних маркерів (SOO97,TNFB), налагодити технологію типування тварин за цими локусами.

3. Проаналізувати структуру популяцій свиней різного напрямку продуктивності і селекції за  традиційними і досліджуваними системами молекулярно-генетичних маркерів:

- імуногенетичну структуру популяції свиней миргородської породи (племзаводи ім. Декабристів та ім. Шевченка миргородського району Полтавської області), динаміку мікроеволюційних процесів в стадах провідних племгосподарств,

- імуногенетичну структуру полтавської м'ясної породи і визначити внесок порід-засновників в її формування.

-вивчити генетичні взаємовідносини між генеалогічними групами тварин в стадах;

- визначити генетико-популяційні показники за допомогою ДНК-маркерів,

4.Встановити кореляції між мікросателітними і еритроцитарними антигенними локусами; дослідити генетичну варіабельність популяцій, що оцінюється за допомогою імуногенетичних і ДНК-маркерів.

Об'єкт дослідження. Обєктом  досліджень виступає геном свині, його поліморфізм, що виявляється за допомогою імуногенетичних та ДНК-маркерів.

Предмет дослідження. Предметом досліджень є генетичні процеси, які відбуваються в стадах свиней, що належать провідним племінним господарствам Полтавської області: племзаводам ім. Декабристів та ім. Шевченка (миргородська порода), "Світанок" (полтавська м'ясна порода) та ін.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні створені технології типування  тварин за геном гормона роста і ріанодин-рецепторним геном і отримані популяційні характеристики вітчизняних комерційних порід свиней за цими локусами.

Встановлено зв'язок генотипів RYR1-гена з показником життєздатності поросят раннього віку.

Вперше були досліджені мікросателітні локуси ДНК свиней полтавської м'ясної і миргородської порід.

Модифікований метод виділення ДНК із м'язевої тканини свиней.

Проведена оцінка генетичної диференціації полтавської м'ясної породи і порід-засновників та ступеня внеску кожної з них в формування її генетичної структури із застосуванням імуногенетичних маркерів та сучасних статистико-математичних моделей.

Вперше досліджено динаміку мікроеволюційних процесів, що відбувалися в провідному стаді миргородської породи свиней.

Проведено співставленя генетичної інформативності систем мікросателітних маркерів  з традиційними імуногенетичними.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень вносять значний внесок у розвиток окремих галузей генетики свині.

Продемонстрована можливість застосування  поліморфних систем (гормона росту та ріанодинрецепторного гена) для прогнозування продуктивних якостей свиней. Аналіз високополіморфних систем мікросателітної ДНК, поряд з традиційними імуногенетичними, є надійним підходом щодо характеристики генофондів різних популяцій і порід свиней. Реалізація методів, які були розроблені, здатні прискорити ефективність селекційного процесу за рахунок підвищення точності родоводів, дослідження процесів диференціації та консолідації порід, типів, та генеалогічних груп.

Запропановані нами молекулярно-генетичні системи придатні для дослідження генофонду малочисельних та аборигенних порід з метою планування заходів по їх збереженню та вдосконаленню.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи автором особисто проведена серія лабораторних дослідів по типуванню свиней за имуногенетичними і ДНК-маркерними системами, методики досліджень останніх розроблені дисертантом особисто. Обгрунтування теоретичних положень, виконання збору, обробки і аналізу експериментальних даних належать особисто здобувачеві. При проведенні ретроспективного аналізу мікроеволюційних процесів в популяціях  полтавської мясної і миргородської порід свиней, використовувалися матеріали лабораторії генетики ІСУААН за попередні роки..

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались  на Вчених Радах ІСУААН, науково-практичній конференції по проблемам свинарства (м. Жодіно, Білорусь, 1995), міжнародній конференції по агробіотехнологіям рослин і тварин (Київ,1997), міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених "Наукові досягнення в галузі ветеринарної медицини" (м. Харків, 1997), II міжнародній конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях" (м.Одеса,1998), VII -міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні проблеми розвитку тваринництва" (м.Жодіно, Білорусь,2000).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень викладені в 7 статтях, друкованих в журналах і збірниках , та 5 тезах наукових конференцій.

Впровадження результатів в практику. Впроваджено в практику селекційної роботи племзаводу "Світанок" дослідного господарства ІС УААН молекулярно-генетичного тесту на стрессиндром свиней. Запропановані методи ДНК-типування застосовуються для проведення генетичного моніторингу стад свиней місцевої селекції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на  146 сторінках містить 24 таблиці, 17 рисунків  і складається з вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і рекомендацій виробництву, використаних джерел (234 джерела, в тому числі 135 іноземних авторів) та 1 додаток.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Виконані дослідження є складовою частиною тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту свинарства УААН. Весь обсяг лабораторних досліджень був проведений на базі лабораторії генетики ІС УААН. Основний обєм робіт було виконано на чистопородних свинях полтавської мясної породи (племзавод "Світанок" Полтавського району, Полтавської області), миргородської породи (племзавод ім. Декабристів, ім.Шевченка, Миргородського району, Полтавської області).

Відбір проб крові і тканин від свиней для проведення імунологічних досліджень і ДНК-типування проводили за загальновизнаною методикою (Тихонов В.М., 1991 р.). Виділення ДНК проводили трьома методами: сольовим (Соколов Б.П., Джемелинский В.В., 1989), сорбентним ("БАТ", м.Харків, 1996р.) і за допомогою реагенту "Chelex-100" (Claude R., 1997). Концентрацію та ступінь очищення ДНК визначали спектрофотометрично. Нативність ДНК - шляхом електрофорезу в 1% агарозному гелі (Маниатис Т., та ін., 1984). Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК проводили в 1%, 2% агарозному та 6%, 10% поліакріламідному гелях у тріс-боратному електрофорезному буфері, згідно методичних рекомендацій (Маниатис Т., та ін. 1984). Фарбування гелів здійснювали за допомогою бромистого етидію. Візуалізацію фрагментів ДНК проводили в УФ світлі та фотографували на плівку високої чутливості (Мікрат-300). Розміри фрагментів ДНК визначали за допомогою маркерів молекулярної маси (ДНК фага λ, плазміди рВR 322, що оброблені ферментами рестрикції, відповідно, pSTI та Hae II) на електрофореграмах (Маниатис, Фрич Э, Сембрук Д., 1984).

Локус-специфічну ампліфікацію фрагментів гена гормону росту проводили в автоматичному режимі на термоциклері "Bioterm 91" (Росія) за схемою, яка складається з 30 циклів з такими параметрами: денатурація ДНК- 1 хв., 94°С, ренатурації праймерів- 1.5 хв., 58°С, синтез ДНК - 3 хв., 70°С. Використовували олігонуклеотидні праймери які обмежували різні ділянки гена гормона росту (Балацкий В.Н., 1998).

Локус-специфічну ампліфікацію фрагмента ріанодин-рецепторного гена проводили за допомогою ПЛР, згідно методичних рекомендацій (Брем Г., Бренінг, 1993).  Рестрикцію отриманого ампліфікату здійснювали додаванням безпросередньо в реакційну суміш 2 од. активності фермента Cfo-1 і інкубації зразка 1,5 години при температурi 37 °С.

Ампліфікацію мікросателітних локусів ДНК в ПЛР здійснювали із використанням праймерів (Ellegren H., et al., 1993) за методикою (Почерняєв К.Ф., 1997). Проводили 30 циклів ампліфікації за слідуючими параметрами: 1 хвилина - 94 °C, 1 хвилина - 60 °C (SOO97) та 65°C (SSTNFB), 1 хвилина - 70°C. Останній цикл ампліфікації: 1 хвилина - 94 °C, 3 хвилини - 60 °C, 6 хвилин - 70°С.

Антигени еритроцитів свиней A,B,D,E,F,G,H,K,L,M визначали з використанням ідентифікованих за міжнародними стандартами реагентів у лабораторії генетики ІС УААН за реакцією агглютинації, непрямої проби Кумбса і гемолітичного теста [Тихонов В.Н., 1991; Тихонов В.Н., 1966].

Основні популяцийно-генетичні параметри груп тварин були обчислені за домопогою персонального комп'ютера IBM PC АT 386 в лабораторії генетики ІСУААН з використанням стандартної програми "BYOSIS-1" (Swofford D.L., Selander A.W.F., 1981), що була модифікована і адаптована в лабораторії генетики ІС УААН для обробки даних імуногенетичного аналізу.

Популяційно-генетичні характеристики та основні статистичні параметри (вірогідність, крітерій χ2) за іншими класами маркерів обчислені за допомогою мікрокалькулятора МК-61, згідно відповідних методик [Айала Ф., 1984; Плохинский Н.А., 1969].

РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Поліморфна система гена гормона росту. Ген гормона росту свині складається з 2231 пар основ та містить у собі такі складові частини: п'ять екзонів, чотири інтрони та фланкуючі ділянки.

При оптимізації умов ампліфікації використовували набір праймерів (PG1, PG2, M, N, L2, I2, K), а також праймери до гена гормона росту бугая (BG3M, BG10M, BG4 ). Праймери використовувалися у різних варіантах поєднань. Найбільш вдалі комбінації утворювали специфічний продукт ампліфікації: BG3/BG10 давали фрагмент розміром 343 п.н., BG3/N - 1061 п.н.

При підборі оптимальних умов ампліфікації змінювали температурні параметри, а також концентрацію основних реакційних компонентів: хлориду магнію, полімерази та геномної ДНК. На подальших етапах проводився рестриктний аналіз фрагментів гена з метою виявлення його алельних варіанті